酶標儀單、雙波長檢測的比較

酶標儀單、雙波長檢測的比較
             邱娜
【關鍵詞】　酶標儀　　波長
【中圖分類號】　R446. 11　　【文獻標識碼】　B　　【文章編號】　167122587 (2007) 0120061201
應用酶聯免疫法測定抗原或抗體時, 結果的判讀要求使用酶標儀, 一般酶標儀有單波長和雙波長兩種測定模式,且采用的都是垂直光路。在日常工作材料與方法
1　材料　由上海科華公司提供乙肝表面抗原測定試劑盒,50～ 200 Ll 的移液器。
2　儀器　酶標儀HT 3 (奧地利)。
3　方法　底物液的配制: 顯色劑A、B 各5 m l 混合, 加入微量酶標記物, 再加入5 m l 終止液, 呈微黃色液體混勻待用。
利用上海科華公司提供的乙肝表面抗原試劑盒的酶標板,于94 孔中準確加入150 Ll 配制好的上述底物液, 另2 孔加入150 Ll 已終止的空白底物液作空白, 在酶標儀HT 3 上分別進行450 nm 單波長和450 nm 及620 nm 雙波長檢測吸光度2 次。
結　　果
　單、雙波長測定結果不同, 雙波長測定結果的CV 值遠小于單波長測定結果。見表1～ 2。表中, 如果不能正確選用單波長或雙波長, 易出現測定孔的數值為負數或弱陽性甚至漏檢的現象.
　單波長比色是通過對顯色具有最大吸收的波長如450nm 或492 nm 進行比色測定, 而雙波長則是酶標儀在敏感波長如450 nm 和非敏感波長620 nm 下各測定1 次, 敏感波長下的吸光度測定值為測定酶反應特異性顯色的吸光度與板底上被臟物污染后的吸光度之和, 非敏感波長下測定, 是改變波長至一定值, 使酶反應特異顯色的吸光度值為零, 此時測得的吸光度即為臟物的吸光度, 最后酶標儀給出的數值為敏感波長吸光度值與非敏感波長的吸光度值的差。因此, 在實際工作中, 使用雙波長不必設空白孔, 否則可能造成測定孔負數的現象。
　　酶標儀在用單波長測定吸光度時, 除受到板底臟物污染等干擾因素外, 還受液面張力的影響。在檢測過程中, 由于液體表面張力的作用, 光線通過液面時, 除正常被液體吸收一部分外, 尚有部分被折射和反射, 影響吸光度的檢測;使用的是通過光導纖維傳播的點光源, 但機械運動等因素可造成誤差, 不可能保證每孔都在相同部位被檢測, 那么吸光度的重復性將無法得到保證, 造成孔與孔之間有一定的差異(結果見表1)。整塊板單波長檢測的CV 在3% 以上, 吸光度最高值和最低值的相對誤差也較大。　在雙波長測定中, 由于減少了干擾測定的一些因素, 因此測定結果明顯好轉, 整塊板樣本的CV 在3% 以下。此外,性分析結果基本一致。
　　

應用酶聯免疫法測定抗原抗體時, 由于使用的底物不論是鄰苯二胺還是四甲基聯苯胺, 顯色終止后在620 nm 處的吸光度值都只有吸收峰處450 nm 吸光度的1% 以下。因此, 利用雙波長檢測不會影響靈敏度, 建議采用酶聯免疫檢測時, 酶標儀比色應該選用雙波長, 可提高臨界值處標本的分析正確度, 減少實驗誤差。