酶標(biāo)儀單、雙波長檢測的比較

酶標(biāo)儀單、雙波長檢測的比較
             邱娜
【關(guān)鍵詞】　酶標(biāo)儀　　波長
【中圖分類號】　R446. 11　　【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】　B　　【文章編號】　167122587 (2007) 0120061201
應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定抗原或抗體時(shí), 結(jié)果的判讀要求使用酶標(biāo)儀, 一般酶標(biāo)儀有單波長和雙波長兩種測定模式,且采用的都是垂直光路。在日常工作材料與方法
1　材料　由上海科華公司提供乙肝表面抗原測定試劑盒,50～ 200 Ll 的移液器。
2　儀器　酶標(biāo)儀HT 3 (奧地利)。
3　方法　底物液的配制: 顯色劑A、B 各5 m l 混合, 加入微量酶標(biāo)記物, 再加入5 m l 終止液, 呈微黃色液體混勻待用。
利用上海科華公司提供的乙肝表面抗原試劑盒的酶標(biāo)板,于94 孔中準(zhǔn)確加入150 Ll 配制好的上述底物液, 另2 孔加入150 Ll 已終止的空白底物液作空白, 在酶標(biāo)儀HT 3 上分別進(jìn)行450 nm 單波長和450 nm 及620 nm 雙波長檢測吸光度2 次。
結(jié)　　果
　單、雙波長測定結(jié)果不同, 雙波長測定結(jié)果的CV 值遠(yuǎn)小于單波長測定結(jié)果。見表1～ 2。表中, 如果不能正確選用單波長或雙波長, 易出現(xiàn)測定孔的數(shù)值為負(fù)數(shù)或弱陽性甚至漏檢的現(xiàn)象.
　單波長比色是通過對顯色具有最大吸收的波長如450nm 或492 nm 進(jìn)行比色測定, 而雙波長則是酶標(biāo)儀在敏感波長如450 nm 和非敏感波長620 nm 下各測定1 次, 敏感波長下的吸光度測定值為測定酶反應(yīng)特異性顯色的吸光度與板底上被臟物污染后的吸光度之和, 非敏感波長下測定, 是改變波長至一定值, 使酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零, 此時(shí)測得的吸光度即為臟物的吸光度, 最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長吸光度值與非敏感波長的吸光度值的差。因此, 在實(shí)際工作中, 使用雙波長不必設(shè)空白孔, 否則可能造成測定孔負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。
　　酶標(biāo)儀在用單波長測定吸光度時(shí), 除受到板底臟物污染等干擾因素外, 還受液面張力的影響。在檢測過程中, 由于液體表面張力的作用, 光線通過液面時(shí), 除正常被液體吸收一部分外, 尚有部分被折射和反射, 影響吸光度的檢測;使用的是通過光導(dǎo)纖維傳播的點(diǎn)光源, 但機(jī)械運(yùn)動等因素可造成誤差, 不可能保證每孔都在相同部位被檢測, 那么吸光度的重復(fù)性將無法得到保證, 造成孔與孔之間有一定的差異(結(jié)果見表1)。整塊板單波長檢測的CV 在3% 以上, 吸光度最高值和最低值的相對誤差也較大。　在雙波長測定中, 由于減少了干擾測定的一些因素, 因此測定結(jié)果明顯好轉(zhuǎn), 整塊板樣本的CV 在3% 以下。此外,性分析結(jié)果基本一致。
　　

應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定抗原抗體時(shí), 由于使用的底物不論是鄰苯二胺還是四甲基聯(lián)苯胺, 顯色終止后在620 nm 處的吸光度值都只有吸收峰處450 nm 吸光度的1% 以下。因此, 利用雙波長檢測不會影響靈敏度, 建議采用酶聯(lián)免疫檢測時(shí), 酶標(biāo)儀比色應(yīng)該選用雙波長, 可提高臨界值處標(biāo)本的分析正確度, 減少實(shí)驗(yàn)誤差。