各種顯微鏡檢術(shù)介紹

各種顯微鏡檢術(shù)介紹
前面講述了顯微鏡的光學(xué)原理以及附件，下面將分類介紹一下各類研究用鏡檢術(shù)。在生物研究領(lǐng)域，透射式明場(chǎng)顯微鏡得到廣泛應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上各種特殊的鏡檢方法也得到應(yīng)用，如相襯，熒光，干涉，暗場(chǎng)，這些鏡檢方法在高檔顯微鏡上均能同時(shí)實(shí)現(xiàn)。
第一節(jié) 正立式顯微鏡
一． 明視野觀察（Bright field）
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應(yīng)用于病理、檢驗(yàn)，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。
二． 暗視野觀察（Dark field）
暗視野實(shí)際是暗場(chǎng)照明發(fā)。它的特點(diǎn)和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場(chǎng)成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象。
暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象，微塵在強(qiáng)光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。
暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。
暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察，最高達(dá)0.02-0.004mm..
三．相襯鏡檢法（Phase contrast）
在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度），對(duì)于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時(shí)，波長(zhǎng)和振幅變化不大，在明場(chǎng)觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.
相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡。
相襯鏡檢法在裝置上與明場(chǎng)不同，有一些特殊要求：
1． 環(huán)狀光闌（Ring slit）: 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對(duì)應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。
2． 相板（Phase plate）: 裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，叫"補(bǔ)償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。
相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個(gè)方面。
1． 光源要強(qiáng)，全部開啟孔徑光闌；
2． 使用濾色片，使光波近于單色；
四．微分干涉稱鏡檢術(shù)（Differential interference contrast DIC）
微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn)，觀察效果更為逼真。
1． 原理
微分干涉稱鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。
2． 微分干涉稱鏡檢術(shù)所需的特殊部件：
（1） 起偏鏡
（2） 檢偏鏡
（3） 渥拉斯頓棱鏡2 塊
3． 微分干涉稱鏡檢時(shí)的注意事項(xiàng)
（1）因微分干涉襯靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。
（2）具有雙折射性的物質(zhì)，不能達(dá)到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。
（3）倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉襯時(shí)，不能用塑料培養(yǎng)皿。


五 熒光鏡檢術(shù)
熒光鏡檢術(shù)是用短波長(zhǎng)的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，然后觀察。熒光鏡檢術(shù)廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。 1．熒光鏡檢術(shù)一般分為透射和落射式兩種類型。
（1）透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。
（2）落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對(duì)透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明。
2．熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)
（1） 激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。
（2）作油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用"無熒光油"。
（3）熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。
（4）電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。
目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。