各種顯微鏡檢術介紹

各種顯微鏡檢術介紹
前面講述了顯微鏡的光學原理以及附件，下面將分類介紹一下各類研究用鏡檢術。在生物研究領域，透射式明場顯微鏡得到廣泛應用，在此基礎上各種特殊的鏡檢方法也得到應用，如相襯，熒光，干涉，暗場，這些鏡檢方法在高檔顯微鏡上均能同時實現。
第一節 正立式顯微鏡
一． 明視野觀察（Bright field）
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應用于病理、檢驗，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。
二． 暗視野觀察（Dark field）
暗視野實際是暗場照明發。它的特點和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現明亮的象。
暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象，微塵在強光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。
暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進入物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。
暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察，最高達0.02-0.004mm..
三．相襯鏡檢法（Phase contrast）
在光學顯微鏡的發展過程中，相襯鏡檢術的發明成功，是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道，人眼只能區分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標本，當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本.
相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現象，將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差，即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。
相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：
1． 環狀光闌（Ring slit）: 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環形光闌裝在一圓盤內，外面標有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應倍數的物鏡配合使用。
2． 相板（Phase plate）: 裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，叫"補償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。
相襯鏡檢法是一種比較復雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調試非常重要。除此之外還應注意以下幾個方面。
1． 光源要強，全部開啟孔徑光闌；
2． 使用濾色片，使光波近于單色；
四．微分干涉稱鏡檢術（Differential interference contrast DIC）
微分干涉鏡檢術出現于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點，觀察效果更為逼真。
1． 原理
微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現重影現象，使圖象呈現出立體的三維感覺。
2． 微分干涉稱鏡檢術所需的特殊部件：
（1） 起偏鏡
（2） 檢偏鏡
（3） 渥拉斯頓棱鏡2 塊
3． 微分干涉稱鏡檢時的注意事項
（1）因微分干涉襯靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。
（2）具有雙折射性的物質，不能達到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。
（3）倒置顯微鏡應用微分干涉襯時，不能用塑料培養皿。


五 熒光鏡檢術
熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發后而產生長波長的熒光，然后觀察。熒光鏡檢術廣泛應用于生物，醫學等領域。 1．熒光鏡檢術一般分為透射和落射式兩種類型。
（1）透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。
（2）落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現整個視場的均勻照明。
2．熒光鏡檢術的注意事項
（1） 激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象，因此盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應用擋板遮蓋激發光。
（2）作油鏡觀察時，應用"無熒光油"。
（3）熒光幾乎都較弱，應在較暗的室內進行。
（4）電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
目前許多新興生物研究領域應用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。