顯微鏡的光學原理及性能

顯微鏡的光學原理及性能

       傳統的光學顯微鏡主要由光學系統及支撐它們的機械結構組成，光學系統包括物鏡、目鏡和聚光鏡，都是由各種光學玻璃做成的復雜化了的放大鏡。物鏡將標本放大成像，其放大倍率M物由下式決定：M物=Δ∕f’物 ，式中f’物是物鏡的焦距，Δ可理解為物鏡與目鏡間的距離。目鏡將物鏡所成之像再次放大，成一個虛像在人眼前250mm處供人觀察,這是多數人感覺最舒適的觀察位置，目鏡的倍率M目=250/f’目,f’目是目鏡的焦距。顯微鏡的總放大倍率是物鏡與目鏡的乘積，即M=M物*M目=Δ*250∕f’目*f;物。可見，減小物鏡及目鏡焦距將使總放大倍率提高，這是用顯微鏡可以看到細菌等微生物的關鍵,也是其與普通放大鏡的區別所在。
　　那么，是否可以設想無限制地減少f’物f’目，以便提高放大倍率，使我們能看到更加細微的物體呢?回答是否定的！這是因為用以成像的光本質是一種電磁波，因而在傳播過程中免不了產生衍射和干涉現象，就像日常所見水面的波紋遇到障礙時能繞行，兩列水波相遇時能互相加強或削弱一樣。當從一個點狀的發光物點發出的光波進入物鏡時，物鏡的邊框阻礙了光的傳播，產生衍射和干涉，經物鏡后無法再會集于一點，而是形成有一定大小的光斑，外圍還有強度微弱并逐漸減弱的一系列光環，我們稱中心亮斑為艾里斑，兩個發光點靠近到一定距離時兩光斑就會重疊，直至無法確認為兩個光斑。瑞利提出了一個判定標準，認為當兩光斑中心相距等于艾里斑半徑時，兩光斑是能分辨的，經計算，這時候兩個發光點間的距離e=0.61入∕n.sinA=0.61入∕N.A，式中，入為光波波長，人眼可接收的光波波長約為0.4—0.7um，n為發光點所處介質的折射率，如處在空氣中，n≈1，處在水中，n≈1.33，而A為發光點對物鏡邊框張角之半，N.A稱為物鏡的數值孔徑。從上式可見，物鏡能分辨的兩點間的距離受到了光的波長和數值孔徑的限制，由于人眼視覺最敏銳的波長約為0.5um，而A角不可能超過90度，sinA總小于1，對于可用的透光介質最大折射率約為1.5，故 e值始終大于0.2um，這是光學顯微鏡能分辨的最小極限距離。通過顯微鏡放大成像，若想將能被具有某些N.A值的物鏡分辨率的物點間距e放大到足以被人眼分辨，則需M.e≥0.15mm，此處0.15mm為實驗得出的人眼能分辨的置于眼前250mm處兩微物間的最小距離，故M≥（0.15∕0.61入）N.A≈500N.A ，為使觀察不致太費力，M擴大一倍便足夠了，即500N.A≤M≤1000N.A，是顯微鏡總倍率的合理選取范圍，再大的總放大倍率是沒有意義的，因為物鏡數值孔徑已經限制了最小可分辨距離，提高放大倍率已不可能分辨出更小的物體細節了。
　　成像襯度是光學顯微鏡的另一個關鍵問題，所謂襯度，即是像面上相鄰部份間的黑白對比度或顏色差，人眼對于0.02以下的亮度差別是很難判定的，對顏色差別則稍微敏感一些。有些顯微鏡觀察對象，如生物標本，其細節間亮度差別甚小，加之顯微鏡光學系統設計制造誤差使其成像襯度進一步降低而難于分辨，此時，看不清物體細節，不是總放大倍率過低，也不是物鏡數值孔徑太小，而是由于像面襯度太低的緣故。
　　多少年來，人們為提高顯微鏡的分辨能力和成像襯度付出了艱辛的勞動，隨著計算機技術和工具的不斷進步，光學設計的理論和方法也在不斷改進，加上原材料性能的提高，工藝和檢測手段的不斷完善，觀察方法的創新，使光學顯微鏡的成像質量已經接近衍射極限的完善程度，人們將用標本染色、暗場、相襯、熒光、干涉、偏光等觀察技術，使得光學顯微鏡已能適應形形色色標本的研究，雖然近年來電子顯微鏡，超聲顯微鏡等放大成像儀器先后問世，在某些方面具有優勢的性能，但在廉價、方便、直觀、特別是適合生物活體的研究等方面仍無法與光學顯微鏡匹敵，光學顯微鏡仍然牢固地占據著自己的陣地。另一方面，與激光、計算機、新材料技術、信息技術相結合，古老的光學顯微鏡正煥發青春，顯示了旺盛的生命力，數碼顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、近場掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡及具有各種新的功能或能適應各種新的環境條件的儀器層出不窮，更加擴大了光學顯微鏡的應用領域，作為最新的例子。從火星探測車上傳回的巖層顯微圖片是多么令人振奮！我們完全可以相信，光學顯微鏡將會以更新的姿態，造福人類。