紫外檢測器高效液相色譜儀的檢定操作規(guī)程

1. 說明
1.1. 適用范圍：適用于具可變波長紫外檢測器的高效液相色譜儀的檢定。
1.2. 參照依據(jù)：國家技術(shù)監(jiān)督局JJG705-2002“實(shí)驗(yàn)室液相色譜儀檢定規(guī)程”、相關(guān)儀器操作說明書及中國藥典2005版二部附錄VD制定。
1.3. 儀器操作及環(huán)境條件：應(yīng)符合相應(yīng)儀器的操作及維護(hù)規(guī)程(SOP)。
2. 檢定項(xiàng)目和技術(shù)要求
2.1. 泵流量設(shè)定值誤差應(yīng)Ss≤±2%；流量穩(wěn)定性誤差應(yīng)SR≤±2%。
2.2. 柱溫箱溫度設(shè)定值誤差ΔTs應(yīng)不超過±2.0℃；柱溫箱溫度穩(wěn)定性應(yīng)不超過1.0℃。
2.3. 波長示值誤差應(yīng)＜±2nm； 波長重復(fù)性應(yīng)優(yōu)于1nm。
2.4. 定性測量重復(fù)性誤差(5次定量環(huán)進(jìn)樣)應(yīng)RSD≤1.5%。
2.5. 定量測量重復(fù)性誤差(5次定量環(huán)進(jìn)樣)應(yīng)RSD≤1.5%。
2.6. 基線漂移應(yīng)≤5×10-3(Au/h)，基線噪聲應(yīng)≤5×10-4Au。
2.7. 最小檢測濃度應(yīng)不超過4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
2.8. 梯度誤差Gc應(yīng)不超過±3%（無梯度裝置不進(jìn)行此項(xiàng)檢定）。
3. 檢定方法
3.1. 泵流量設(shè)定值誤差Ss，流量穩(wěn)定性誤差SR的檢定
3.1.1. 儀器與用具
     分析天平   萬分之一      秒表       精度0.01秒     容量瓶     50ml
3.1.2. 操作程序
3.1.2.1. 將泵、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測器連接好，以甲醇為流動(dòng)相。
3.1.2.2. 按表1設(shè)定流量，待流速穩(wěn)定后，在流動(dòng)相排出口用事先精密稱定過重量的容量瓶收集流動(dòng)相，同時(shí)用秒表記錄，準(zhǔn)確收集10～25分鐘，再精密稱定其重量。收集時(shí)間
應(yīng)符合下表規(guī)定，每個(gè)設(shè)定值重復(fù)測定3次。
3.1.3. 結(jié)果計(jì)算
按下列公式計(jì)算SS和SR：
Fm=（W2-W1）/（P.t）
SS=（Fm-FS）/FS×100%
SR=(Fmax-Fmin)/F×100%
W2為容量瓶+流動(dòng)相的重量(g)
W1為容量瓶的重量
P為實(shí)驗(yàn)條件下的流動(dòng)相密度(g/cm3)
t為收集流動(dòng)相的時(shí)間(min)P
Fm流量實(shí)測值(ml/min)
FS流量設(shè)定值
Fmin同一組測量中流量最小值
Fmax同一組測量中流量最大值
F為同一組測量中流量的算術(shù)平均值
3.1.4. 結(jié)果判斷：SS和SR值應(yīng)符合下表規(guī)定
流量設(shè)定值(ml/min)        0.5        1.0        1.5
測量次數(shù)        3        3        3
收集流動(dòng)相時(shí)間(min)        25        15        10
允許誤差        SS        3%        2%        2%
        SR        3%        2%        2%
3.1.5. 注意事項(xiàng):收集時(shí)間應(yīng)將“秒”換算為“分”代入公式計(jì)算。
3.2. 柱溫箱溫度設(shè)定值誤差ΔTs、柱溫箱溫度穩(wěn)定性Tc的檢定
3.2.1. 操作步驟：將溫度設(shè)為60℃，將一經(jīng)過校正的溫度計(jì)放入柱溫箱內(nèi)，每隔10min讀取溫度計(jì)顯示溫度與柱溫箱顯示溫度一次，共讀取7次，求出平均值。平均值與設(shè)定值之差為ΔTs，7次讀數(shù)中最大值與最小值之差為控溫穩(wěn)定性Tc。
3.2.2. 結(jié)果判斷：柱溫箱溫度設(shè)定值誤差ΔTs應(yīng)不超過±2.0℃；柱溫箱溫度穩(wěn)定性應(yīng)不超過1.0℃。
3.3. 波長示值誤差及波長重復(fù)性的檢定
3.3.1. 方法
3.3.1.1. 方法一
制備60ug/ml基準(zhǔn)重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液，用一節(jié)空管代替色譜柱將進(jìn)樣器與檢測器連通，以水做流動(dòng)相，流量為0.5～1.0ml/min，采用步進(jìn)進(jìn)樣法，即在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四個(gè)波段處，分別每2min改變1nm，用注射器注入5～10ul（或定量環(huán)）標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測量三次。記錄色譜圖。
3.3.1.2. 方法二
制備60ug/ml基準(zhǔn)重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液，按紫外分光光度法，用1cm石英比色皿分別在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四個(gè)波段處，以0.005mol/L硫酸為空白，測定各波長處60ug/ml基準(zhǔn)重鉻酸鉀的0.005mol/l硫酸溶液的吸收度，各波長重復(fù)測量三次。
3.3.1.3. 方法三
對(duì)于儀器有波長準(zhǔn)確度自檢功能的,可利用其自檢功能進(jìn)行檢查，重復(fù)測量三次。具體詳見相關(guān)儀器操作說明書。
3.3.2. 結(jié)果計(jì)算：
最大（或最小）吸收點(diǎn)對(duì)應(yīng)的波長與標(biāo)準(zhǔn)波長之差即為波長示值誤差。
三次測量平均值與三次測量值中最大差值即為波長重復(fù)性誤差。
3.3.3. 結(jié)果判斷：波長示值誤差應(yīng)＜±2nm；波長重復(fù)性應(yīng)優(yōu)于1nm。
3.4. 基線漂移和基線噪聲的檢定
3.4.1. 色譜條件：
色譜柱：C18
流動(dòng)相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
3.4.2. 操作步驟
將儀器各部份聯(lián)接好，將靈敏度設(shè)置為最靈敏檔，開機(jī)，以甲醇為流動(dòng)相，待基線穩(wěn)定后,記錄基線 10min，計(jì)算基線噪聲。
記錄基線 60min，計(jì)算基線漂移。
3.4.3. 結(jié)果計(jì)算：
Nd=KB
式中：    Nd--檢測器基線噪聲；
K--衰減倍數(shù)；
B--測得的基線峰-峰高對(duì)應(yīng)的記錄儀標(biāo)度，AU
基線漂移用1h內(nèi)基線偏離原點(diǎn)的值（AU/h）表示。
3.4.4. 結(jié)果判斷：
基線漂移≤5×10-3(Au/h)
基線噪聲≤5×10-4Au
3.5. 最低檢測濃度的檢定
3.5.1. 對(duì)照品溶液的配制：用甲醇配制含萘4×10-8g/ml的甲醇溶液。
3.5.2. 色譜條件：
色譜柱：C18
流動(dòng)相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
進(jìn)樣量：20ul（定量環(huán)）
3.5.3. 操作步驟：將儀器各部份聯(lián)接好，以甲醇為流動(dòng)相，開機(jī)，待基線穩(wěn)定后，將上述配制好的對(duì)照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。
3.5.4. 按下式計(jì)算最小檢測濃度：
              Cl=2?Nd?C/H
式中：Cl：最小檢測濃度（g/ml）；
Nd：基線噪聲峰-峰高，mm；
C：對(duì)照品溶液濃度（g/ml）；
H：標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰高，mm。
3.5.5. 結(jié)果判斷：對(duì)照品溶液的峰高應(yīng)大于或等于兩倍基線噪聲峰高，即最低檢測濃度應(yīng)低于4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
3.6. 梯度誤差的檢定
3.6.1.色譜條件
流動(dòng)相：A為純水；B為0.1%丙酮水溶液
流速：1ml/min
波長：254nm
3.6.2. 操作步驟：將輸液泵和檢測器連接（不接色譜柱），開機(jī)后以溶劑A沖洗系統(tǒng)，基線平穩(wěn)后開始執(zhí)行下列梯度程序，記錄色譜圖。重復(fù)測量2次。
3.6.3. 梯度程序：

A：系統(tǒng)是色譜工作站控制的，按下表程序：
時(shí)間        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        80%        20%
8min        1ml/min        80%        20%
10min        1ml/min        60%        40%
13min        1ml/min        60%        40%
15min        1ml/min        40%        60%
18min        1ml/min        40%        60%
20min        1ml/min        20%        80%
23min        1ml/min        20%        80%
25min        1ml/min        0        100%
28min        1ml/min        0        100%
30min        1ml/min        100%        0
B：系統(tǒng)是梯度控制儀控制的，按下表程序：
時(shí)間        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        75%        25%
8min        1ml/min        75%        25%
10min        1ml/min        50%        50%
13min        1ml/min        50%        50%
15min        1ml/min        25%        75%
18min        1ml/min        25%        75%
20min        1ml/min        0        100%
23min        1ml/min        0        100%
25min        1ml/min        100%        0
3.6.4. 結(jié)果計(jì)算：
      
式中：
--第i段梯度誤差（%）；
--第i段輸出信號(hào)值平均值；
--各段輸出信號(hào)平均值的平均值。
3.6.5. 結(jié)果判斷：不超過±3%
3.7. 定性、定量測量重復(fù)性試驗(yàn)
3.7.1. 色譜條件
色譜柱：C18
流動(dòng)相：甲醇
流速：1ml/min
波長：254nm
進(jìn)樣量：20ul（定量環(huán)）
3.7.2.操作程序
將儀器連接好，使之處于正常的工作狀態(tài)，待基線穩(wěn)定后，用進(jìn)樣閥的定量環(huán)注入20ul4×10-5g/ml萘的甲醇溶液或穩(wěn)定的待分析樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄萘的峰保留時(shí)間和峰面積。
3.7.3. 結(jié)果計(jì)算：

式中：
RSD%--定性（定量）測量重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；
Xi--第i次測得的保留時(shí)間或峰面積；
--5次測量結(jié)果的算術(shù)平均值；
i--測量序號(hào)。
3.7.4. 結(jié)果判斷
定性測量重復(fù)性誤差：5次峰保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)≤1.5%。
定量測量重復(fù)性誤差：5次峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)R≤1.5%。
4. 檢定周期
4.1. 法定檢定周期為1年。
4.2. 儀器維修或發(fā)現(xiàn)異常時(shí)應(yīng)全面檢定一次。
4.3. 正常自檢按下表執(zhí)行：
檢 定 項(xiàng) 目        周  期
泵流量設(shè)定值誤差、流量穩(wěn)定性誤差        12個(gè)月
柱溫箱溫度設(shè)定值誤差ΔTs、柱溫箱溫度穩(wěn)定性        12個(gè)月
波長示值誤差、波長重復(fù)性        12個(gè)月
基線噪聲及漂移        12個(gè)月
最小檢測濃度        12個(gè)月
梯度誤差Gc        12個(gè)月
定性、定量測量重復(fù)性誤差        12個(gè)月