顯微鏡的發展及在長度計量中的應用

顯微鏡的發展及在長度計量中的應用
王蔚晨  何冬琦  莫偉平  楊自本



    自16世紀末第一臺顯微鏡發明以來，顯微技術一直是人們探尋和研究微觀世界的有力助手，特別是計算機和激光器的問世更為古老的顯微技術注入了新的生命力。幾個世紀中，顯微鏡從過去傳統的光學顯微鏡逐漸向深度和廣度發展，形成了以不同照明光源和成像原理為區別的一個龐大的顯微鏡家族，如光學顯微鏡、干涉顯微鏡、電子顯微鏡和掃描探針顯微鏡等。而其中每一類顯微鏡又自成體系，向縱深衍生出更多類型的顯微鏡而應用于各個科學技術領域。
   
一、顯微鏡的發展
    從顯微鏡誕生至20世紀20年代的500年間，人類為提高顯微鏡分辨率的努力一直局限在優化顯微鏡分辨極限的表達式中所涉及的光學參數，科學家們竭盡所能尋找波長更短的照明光源和提高物鏡的數值孔徑，以期提高顯微鏡的放大倍數及其分辨率。基于這一思想，長期以來，發展出更多類型、更多用途的顯微鏡。但根據式(1)計算，顯微鏡的分辨極限最好也只能達到波長λ的1/2，因此，工作在可見光波段的光學顯微鏡很難突破0.2mm的分辨極限。
    顯微鏡家族成員眾多，分類方法也多種多樣。按照成像原理劃分，可分為光學顯微鏡、干涉顯微鏡、共焦顯微鏡以及掃描探針顯微鏡；按照信息載體波長的由大到小劃分，可將顯微鏡分為傳統光學顯微鏡和非可見光源照明顯微鏡；按照工作方式劃分可分為近場顯微鏡和遠場光學顯微鏡等，如圖1所示。
   

    圖1  顯微鏡發展簡圖

    但無論是成像原理上還是照明光源上的區別，各種類型顯微鏡的共同點均是基于軸向放大功能的儀器，根據放大原理和方式的不同得到不同類型的顯微鏡，其放大能力也有所不同，表1列出了現有應用較為廣泛的顯微鏡的分辨率數值。
   

    表1  常見顯微鏡的分辨率

    1.傳統光學顯微鏡
    傳統的光學顯微鏡是以光波作為信息載體實現對樣品的觀察的，因而光學顯微鏡最突出的優點是對被觀察物體不構成損傷，且對樣品限制少，即對樣品的狀態、屬性、材料、溫度、透明與否等都無限制，對測量環境也無特殊要求，這使得它的應用范圍非常廣泛。因此，在非光學顯微鏡的分辨率已經達到原子級(0.1nm)水平的今天，提高光學顯微鏡的分辨率仍具有重大意義。
    光學顯微鏡按照其功能大致可分為觀察用顯微鏡和測量用顯微鏡兩大類。觀察用顯微鏡主要包括生物顯微鏡、金相顯微鏡等，主要應用于醫療、教學、機械制造、電子等領域。測量用顯微鏡則包括讀數顯微鏡、測量顯微鏡、工具顯微鏡、光切顯微鏡、干涉顯微鏡等，在工業生產、產品檢驗、計量測試、科學研究、航天航空等領域，其作為主要的測量工具發揮著重要的作用。
    2.新型顯微鏡
    為了突破傳統光學顯微鏡的測量極限，科學家們努力尋找不同光源作為顯微鏡的信息載體，超聲顯微鏡、X射線顯微鏡和電子顯微鏡等應運而生。
    (1)超聲顯微鏡
    超聲顯微鏡(以下簡稱“聲鏡”)是以超聲波為載體，并使其沿一定路徑傳播、轉換，從而顯示物體細微結構的顯微裝置。聲鏡的工作原理是:入射到物體上的聲波經過反射、折射、衍射、吸收等聲學現象與物體發生相互作用而攜帶了物質的信息，這些信息反映了物體結構、性質等特性，把攜帶物質信息的聲波顯示出來即實現了聲成像。聲鏡的成像過程如圖2所示。壓電換能器由信號源激發產生超聲波，經超聲透鏡聚焦成細聲束，通過耦合介質-水入射到被測樣品，穿過樣品到達對面的共聲透鏡，攜帶樣品信息的聲波經壓電換能器在此將聲波轉換為電信號并經接收電路送到示波器，樣品放在載物臺上可作二維移動，聚焦聲束在樣品上作逐點逐行的掃描，示波器可顯示出物體被照射部位的聲像。為了獲得短波長聲波，從而提高聲鏡的分辨率，美國斯坦福大學將傳導介質換成低溫液氦，使聲鏡的分辨率達到了50nm。
   

    圖2  聲鏡原理圖

    聲鏡是利用物體聲學特性的差異來顯示物體的，物體的聲學特性是指聲阻抗和聲衰減，這些參數與物體結構、成分、彈性等有關，而與物體的透光性和顏色無關。基于這一機理，聲鏡顯示出其顯著的特點:一是被測物體無需透光；二是樣品無需進行染色處理，即無需損壞樣品就可進行內部觀察。因而，聲鏡在生物、醫學、微電子學以及材料學中得以廣泛應用。例如，利用聲鏡進行活體樣本觀察、對大規模集成電路不同層次和層間細節進行非破壞性觀察、對材料表面層斷裂韌性進行測定等。因此，聲鏡與光學顯微鏡和電子顯微鏡相互補充，成為現代顯微技術發展進程中的一個重要里程碑。
    (2)電子顯微鏡
    電子顯微鏡是以電子束為照明光源的顯微鏡，由于電子波的波長大大小于可見光的波長(約為紫光波長的十萬分之一)，根據式(1)可知，電子顯微鏡的分辨本領應大大優于光學顯微鏡。現代電子顯微鏡的分辨率已經可以達到0.1nm。電子顯微鏡可分為掃描電子顯微鏡(以下簡稱“掃描電鏡”，SEM)和透射電子顯微鏡(以下簡稱“透射電鏡”，TEM)兩大類。
    掃描電鏡是利用聚焦電子束垂直于被測物體進行掃描，檢測其背向散射電子和二次發射電子信號的變化獲得樣品形貌襯度像。掃描電鏡的基本工作過程如圖3所示，用電子束在樣品表面掃描，同時，陰極射線管內的電子束與樣品表面的電子束同步掃描，將電子束在樣品上激發的各種信號用探測器接收，并用它來調制顯像管中掃描電子束的強度，在陰極射線管的屏幕上就得到了相應襯度的掃描電子顯微像。由于獲得的電子像的分辨率和景深都遠遠高于光學顯微鏡，因此，掃描電鏡可在比微米尺寸更小的范圍獲得高倍率、立體感強且直觀的顯微形貌像。目前，商用掃描電鏡的分辨率可達到納米級。此外，利用能譜儀等附件掃描電鏡在對樣品進行形貌觀察的同時，還可對樣品成分、結構以及電特性進行分析。
   

    圖3  掃描電鏡工作原理

    透射電鏡的工作機理是利用電子束在外部磁場或電場的作用下發生彎曲，形成類似于可見光經過玻璃時的透射現象，稱為電子束“透鏡”，利用透過樣品的電子束成像。透射電鏡在材料科學研究領域發揮了重要作用，可實現樣品形貌觀察、物相分析、確定晶格結構、觀察晶格缺陷、化學成分分析、元素分析等功能，成為在光學顯微鏡不能達到要求時進行微觀分析和檢測的不可或缺的工具。
    (3)X射線顯微鏡
    20世紀50年代以來，出現了一種不用光波或電子而用X射線作為信息載體的顯微鏡，它為人們提供了一種更深入觀察微觀世界的方法。X射線是指波長為(0.01～30)nm的輻射波，其中，(1～30)nm的波段稱為軟X射線。近年來，世界范圍內積極進行的X射線顯微術方面的研究主要集中在軟X射線波段。軟X射線顯微鏡的突出優點是可以在生物活細胞被破壞之前得出其表面特征和內部結構的圖像，這是電子顯微鏡無法得到的。自20世紀70年代以來，隨著X射線激光器的開發與發展，獲得了短脈沖、高亮度和相干性強的X射線激光光源，此外，用于X射線的光學元件與高分辨率、高靈敏度的X射線探測器技術的發展為X射線顯微鏡的發展創造了必要條件，使其具有高空間分辨、能譜分辨和時間分辨能力。
    目前，X射線顯微鏡主要包括接觸型、成像型、掃描型以及全息型四種類型。圖4為軟X射線接觸顯微成像示意圖，它用光敏物質作為抗蝕材料，將實驗樣品貼在對X射線靈敏的感光膠上，經過軟X射線曝光及顯影，再用電子顯微鏡觀察其影像即可得到細胞的顯微圖，這種方法比較簡單和方便，分辨率可達10nm。
   

    圖4  軟X射線接觸顯微成像簡圖

   （待續）

成像型軟X射線顯微鏡模擬光學成像原理，用聚焦系統將影像放大數百倍，然后由光電耦合(CCD)探測器實時記錄，聚焦系統以波帶片代替透鏡。這種方法的優點是可以照射整個樣品并實時成像，非常適合實際應用，其分辨率可達(50～60)nm。軟X射線掃描顯微鏡是用波帶片將軟X射線聚焦成一個微束，照亮樣品上的一個點，該點對X射線的透射率確定了像素的灰度值，對樣品逐行逐點進行掃描，圖像便以一次一個像素方式形成，很像電視屏上的圖像。這種顯微鏡的優點是樣品輻射損傷小，缺點是需逐點記錄得出圖像，要求空間相干照明，且不能使用脈沖X射線光源。全息型X射線顯微鏡基于波的干涉原理，它不需要聚焦裝置，只需要強X射線光源和高分辨率的記錄材料，可獲得樣品的三維全息影像。用(0.1～1)nm的X射線激光全息術可進行表面物理、原子分子物理、化學反應動力等高分辨率快速過程的研究。
    X射線顯微鏡與電子顯微鏡功能上互為補充，電子顯微鏡可達到極高的分辨率——(0.2～2)nm，現有X射線顯微鏡的分辨率是在幾十納米的量級，由于受到X射線衍射限度的限制，X射線顯微鏡的分辨率難以超越電子顯微鏡。因此，X射線顯微鏡的主要貢獻并不在于分辨率極限的突破，而在于它在很接近于生物體自然狀態的環境下，對改變很少或完全沒有改變的生物樣品進行定量測定的能力。因此，X射線顯微鏡在生物醫學領域中的應用更加引人注目，從被重金屬污染了的生物到人體內的癌細胞，X射線顯微鏡為人類在原子尺度考察生命提供了幫助。
    (4)近場顯微鏡
    近場顯微鏡的概念是由Wickramasinghe提出的，最早由掃描探針顯微鏡(SPM)的測量原理延伸得到。它是一種全新的測量原理，即使得一個非常尖的探針非常近地接近樣品，使之與被測表面在近場范圍產生掃描力，對這種掃描力進行探測可獲得樣品表面的形貌信息。近場顯微鏡具有非常高的分辨率，因為它區別于傳統光學顯微鏡之處在于，不再用光子或粒子束照亮樣品，因而突破了由于射線衍射造成的分辨率極限。近場顯微鏡的關鍵之處是各種形式的探針在原子直徑量級上的精確機械掃描，以及探針在近場范圍對樣品表面進行原子和分子量級的探測。
    掃描探針顯微鏡家族的第一個成員是掃描隧道顯微鏡(STM)，它是由IBM瑞士蘇黎世實驗室的G.Beinning和H.Rohrer于1982年發明的，接下來是原子力顯微鏡(AFM)。此后，又陸續發明了多種利用掃描力測量的顯微鏡，如近場光學顯微鏡(NOM)、近場聲學顯微鏡(NAM)、摩擦力顯微鏡(FFM)、磁力顯微鏡(MFM)、靜電力顯微鏡(EFM)和化學力顯微鏡(CFM)等，使得SPM的組成和應用領域大大擴大。
    SPM作為新型顯微工具與以往的各種顯微鏡和分析儀器相比有著其明顯地優勢:首先，SPM具有極高的分辨率。它可以輕易地“看到”原子，這是一般顯微鏡甚至電子顯微鏡所難以達到的。其次，SPM得到的是實時的、真實的樣品表面的高分辨率圖像，而不同于某些分析儀器是通過間接的或計算的方法來推算樣品的表面結構。也就是說，SPM是真正看到了原子。再次，SPM的使用環境寬松。電子顯微鏡等儀器對工作環境要求比較苛刻，樣品必須安放在高真空條件下才能進行測試。而SPM既可以在真空中工作，又可以在大氣中、低溫、常溫、高溫甚至在溶液中使用。因此，SPM適用于各種工作環境下的科學實驗。SPM的缺點在于:一方面，由于其工作原理是控制具有一定質量的探針進行掃描成像，因此掃描速度受到限制，檢測效率較其他顯微技術低；此外，由于壓電效應在保證定位準確度前提下運動范圍很小(目前難以突破100μm量級)，而機械調節準確度又無法與之銜接，故不能做到像電子顯微鏡那樣大范圍連續變焦，定位和尋找特征結構比較困難。雖然存在缺點，但SPM的應用領域還是非常寬廣的，無論是物理、化學、生物、醫學等基礎學科，還是材料、微電子等應用學科都有它的用武之地。預計在未來的科學發展中，SPM將具有更大的應用前景。
    三、顯微技術在長度計量中的應用
    顯微技術是長度計量的基本技術，近年來，顯微技術與光干涉技術相結合在長度計量領域的各分支(如量塊計量、角度計量、工程參量計量、表面輪廓以及納米計量)中發揮了重要作用，使得古老的顯微技術煥發了新的活力。
    1.在幾何尺寸測量中的應用
    測量顯微鏡是長度計量的常用精密測量儀器，主要用于工件幾何尺寸的測量。從小型測量顯微鏡到大型工具顯微鏡，測量顯微鏡的類型多種多樣，測量準確度一般為微米量級，分辨率可達到0.1μm。
    2.在表面形貌測量中的應用
    表面形貌測量是長度計量的一個分支，傳統儀器有光切顯微鏡和干涉顯微鏡，光切顯微鏡的分辨率最高可達到0.1mm，而干涉顯微鏡則可達到15nm。它們所針對的主要是微米、亞微米量級的工件粗糙度的測量。
    隨著表面加工質量的不斷提高，對微觀形貌測量技術提出了更高的要求。輪廓儀、掃描電鏡以及掃描探針顯微鏡的應用解決了這一問題。其中，STM和AFM的發明為表面形貌測量的進一步發展注入了新的活力，使其步入了納米時代。當前，表面形貌測量正朝著應用非接觸式且具有高分辨率，以及可對表面結構和成分進行描繪的電子顯微鏡方向發展。
    3.在線寬和掩模測量中的應用
    隨著電子行業的發展，特別是超大規模集成芯片制造業的進一步發展，電子元器件向著結構尺寸小型化和高集成密度化方向前進，從而對線寬計量和掩模計量提出更高的需求。近年來，共焦顯微鏡的應用為線寬和掩模測量提供了新的測量手段。共焦顯微鏡的原理如圖5所示，激光通過一個長焦透鏡后形成發散光束，再經短焦物鏡匯聚透射到樣品表面并反射回短焦物鏡，經分光鏡后通過一個小孔光闌由光電接收器接收。小孔光闌的位置正好位于長焦透鏡的焦點上，因而構成共焦關系。當測量點正好位于物鏡焦點上時，光電接收器上可得到最大的信號，隨著測量點偏離焦點，信號隨之變小，信號的大小即反映了樣品表面高低的變化。小孔的直徑對其測量分辨率起決定作用，目前，共焦顯微鏡的測量分辨率可達到10nm。
   

    圖5  共焦顯微鏡成像原理圖

四、結束語
    回顧幾百年來顯微技術的發展，顯微鏡就像人類的第三只眼睛，為我們探索和研究微觀世界開啟了一扇門。近幾十年，顯微技術的奮斗目標主要是力求觀察更微小的物體結構、更細小的實體，甚至單個原子，并獲得有關試樣的更多的信息。古老的顯微技術在激光技術和電子技術的激勵下迸發出新的能量。相信在未來的科學發展中，現代新型顯微鏡的應用將滲透到各個科學技術領域。
    作者單位【王蔚晨  楊自本  中國計量科學研究院、何冬琦  廣東省計量科學研究院、莫偉平  云南省計量測試技術研究院】