顯微鏡的發(fā)展及在長(zhǎng)度計(jì)量中的應(yīng)用

顯微鏡的發(fā)展及在長(zhǎng)度計(jì)量中的應(yīng)用
王蔚晨  何冬琦  莫偉平  楊自本



    自16世紀(jì)末第一臺(tái)顯微鏡發(fā)明以來(lái)，顯微技術(shù)一直是人們探尋和研究微觀(guān)世界的有力助手，特別是計(jì)算機(jī)和激光器的問(wèn)世更為古老的顯微技術(shù)注入了新的生命力。幾個(gè)世紀(jì)中，顯微鏡從過(guò)去傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡逐漸向深度和廣度發(fā)展，形成了以不同照明光源和成像原理為區(qū)別的一個(gè)龐大的顯微鏡家族，如光學(xué)顯微鏡、干涉顯微鏡、電子顯微鏡和掃描探針顯微鏡等。而其中每一類(lèi)顯微鏡又自成體系，向縱深衍生出更多類(lèi)型的顯微鏡而應(yīng)用于各個(gè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
   
一、顯微鏡的發(fā)展
    從顯微鏡誕生至20世紀(jì)20年代的500年間，人類(lèi)為提高顯微鏡分辨率的努力一直局限在優(yōu)化顯微鏡分辨極限的表達(dá)式中所涉及的光學(xué)參數(shù)，科學(xué)家們竭盡所能尋找波長(zhǎng)更短的照明光源和提高物鏡的數(shù)值孔徑，以期提高顯微鏡的放大倍數(shù)及其分辨率。基于這一思想，長(zhǎng)期以來(lái)，發(fā)展出更多類(lèi)型、更多用途的顯微鏡。但根據(jù)式(1)計(jì)算，顯微鏡的分辨極限最好也只能達(dá)到波長(zhǎng)λ的1/2，因此，工作在可見(jiàn)光波段的光學(xué)顯微鏡很難突破0.2mm的分辨極限。
    顯微鏡家族成員眾多，分類(lèi)方法也多種多樣。按照成像原理劃分，可分為光學(xué)顯微鏡、干涉顯微鏡、共焦顯微鏡以及掃描探針顯微鏡；按照信息載體波長(zhǎng)的由大到小劃分，可將顯微鏡分為傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和非可見(jiàn)光源照明顯微鏡；按照工作方式劃分可分為近場(chǎng)顯微鏡和遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡等，如圖1所示。
   

    圖1  顯微鏡發(fā)展簡(jiǎn)圖

    但無(wú)論是成像原理上還是照明光源上的區(qū)別，各種類(lèi)型顯微鏡的共同點(diǎn)均是基于軸向放大功能的儀器，根據(jù)放大原理和方式的不同得到不同類(lèi)型的顯微鏡，其放大能力也有所不同，表1列出了現(xiàn)有應(yīng)用較為廣泛的顯微鏡的分辨率數(shù)值。
   

    表1  常見(jiàn)顯微鏡的分辨率

    1.傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡
    傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡是以光波作為信息載體實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的觀(guān)察的，因而光學(xué)顯微鏡最突出的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)被觀(guān)察物體不構(gòu)成損傷，且對(duì)樣品限制少，即對(duì)樣品的狀態(tài)、屬性、材料、溫度、透明與否等都無(wú)限制，對(duì)測(cè)量環(huán)境也無(wú)特殊要求，這使得它的應(yīng)用范圍非常廣泛。因此，在非光學(xué)顯微鏡的分辨率已經(jīng)達(dá)到原子級(jí)(0.1nm)水平的今天，提高光學(xué)顯微鏡的分辨率仍具有重大意義。
    光學(xué)顯微鏡按照其功能大致可分為觀(guān)察用顯微鏡和測(cè)量用顯微鏡兩大類(lèi)。觀(guān)察用顯微鏡主要包括生物顯微鏡、金相顯微鏡等，主要應(yīng)用于醫(yī)療、教學(xué)、機(jī)械制造、電子等領(lǐng)域。測(cè)量用顯微鏡則包括讀數(shù)顯微鏡、測(cè)量顯微鏡、工具顯微鏡、光切顯微鏡、干涉顯微鏡等，在工業(yè)生產(chǎn)、產(chǎn)品檢驗(yàn)、計(jì)量測(cè)試、科學(xué)研究、航天航空等領(lǐng)域，其作為主要的測(cè)量工具發(fā)揮著重要的作用。
    2.新型顯微鏡
    為了突破傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的測(cè)量極限，科學(xué)家們努力尋找不同光源作為顯微鏡的信息載體，超聲顯微鏡、X射線(xiàn)顯微鏡和電子顯微鏡等應(yīng)運(yùn)而生。
    (1)超聲顯微鏡
    超聲顯微鏡(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“聲鏡”)是以超聲波為載體，并使其沿一定路徑傳播、轉(zhuǎn)換，從而顯示物體細(xì)微結(jié)構(gòu)的顯微裝置。聲鏡的工作原理是:入射到物體上的聲波經(jīng)過(guò)反射、折射、衍射、吸收等聲學(xué)現(xiàn)象與物體發(fā)生相互作用而攜帶了物質(zhì)的信息，這些信息反映了物體結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等特性，把攜帶物質(zhì)信息的聲波顯示出來(lái)即實(shí)現(xiàn)了聲成像。聲鏡的成像過(guò)程如圖2所示。壓電換能器由信號(hào)源激發(fā)產(chǎn)生超聲波，經(jīng)超聲透鏡聚焦成細(xì)聲束，通過(guò)耦合介質(zhì)-水入射到被測(cè)樣品，穿過(guò)樣品到達(dá)對(duì)面的共聲透鏡，攜帶樣品信息的聲波經(jīng)壓電換能器在此將聲波轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并經(jīng)接收電路送到示波器，樣品放在載物臺(tái)上可作二維移動(dòng)，聚焦聲束在樣品上作逐點(diǎn)逐行的掃描，示波器可顯示出物體被照射部位的聲像。為了獲得短波長(zhǎng)聲波，從而提高聲鏡的分辨率，美國(guó)斯坦福大學(xué)將傳導(dǎo)介質(zhì)換成低溫液氦，使聲鏡的分辨率達(dá)到了50nm。
   

    圖2  聲鏡原理圖

    聲鏡是利用物體聲學(xué)特性的差異來(lái)顯示物體的，物體的聲學(xué)特性是指聲阻抗和聲衰減，這些參數(shù)與物體結(jié)構(gòu)、成分、彈性等有關(guān)，而與物體的透光性和顏色無(wú)關(guān)。基于這一機(jī)理，聲鏡顯示出其顯著的特點(diǎn):一是被測(cè)物體無(wú)需透光；二是樣品無(wú)需進(jìn)行染色處理，即無(wú)需損壞樣品就可進(jìn)行內(nèi)部觀(guān)察。因而，聲鏡在生物、醫(yī)學(xué)、微電子學(xué)以及材料學(xué)中得以廣泛應(yīng)用。例如，利用聲鏡進(jìn)行活體樣本觀(guān)察、對(duì)大規(guī)模集成電路不同層次和層間細(xì)節(jié)進(jìn)行非破壞性觀(guān)察、對(duì)材料表面層斷裂韌性進(jìn)行測(cè)定等。因此，聲鏡與光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡相互補(bǔ)充，成為現(xiàn)代顯微技術(shù)發(fā)展進(jìn)程中的一個(gè)重要里程碑。
    (2)電子顯微鏡
    電子顯微鏡是以電子束為照明光源的顯微鏡，由于電子波的波長(zhǎng)大大小于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)(約為紫光波長(zhǎng)的十萬(wàn)分之一)，根據(jù)式(1)可知，電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)應(yīng)大大優(yōu)于光學(xué)顯微鏡。現(xiàn)代電子顯微鏡的分辨率已經(jīng)可以達(dá)到0.1nm。電子顯微鏡可分為掃描電子顯微鏡(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“掃描電鏡”，SEM)和透射電子顯微鏡(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“透射電鏡”，TEM)兩大類(lèi)。
    掃描電鏡是利用聚焦電子束垂直于被測(cè)物體進(jìn)行掃描，檢測(cè)其背向散射電子和二次發(fā)射電子信號(hào)的變化獲得樣品形貌襯度像。掃描電鏡的基本工作過(guò)程如圖3所示，用電子束在樣品表面掃描，同時(shí)，陰極射線(xiàn)管內(nèi)的電子束與樣品表面的電子束同步掃描，將電子束在樣品上激發(fā)的各種信號(hào)用探測(cè)器接收，并用它來(lái)調(diào)制顯像管中掃描電子束的強(qiáng)度，在陰極射線(xiàn)管的屏幕上就得到了相應(yīng)襯度的掃描電子顯微像。由于獲得的電子像的分辨率和景深都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡，因此，掃描電鏡可在比微米尺寸更小的范圍獲得高倍率、立體感強(qiáng)且直觀(guān)的顯微形貌像。目前，商用掃描電鏡的分辨率可達(dá)到納米級(jí)。此外，利用能譜儀等附件掃描電鏡在對(duì)樣品進(jìn)行形貌觀(guān)察的同時(shí)，還可對(duì)樣品成分、結(jié)構(gòu)以及電特性進(jìn)行分析。
   

    圖3  掃描電鏡工作原理

    透射電鏡的工作機(jī)理是利用電子束在外部磁場(chǎng)或電場(chǎng)的作用下發(fā)生彎曲，形成類(lèi)似于可見(jiàn)光經(jīng)過(guò)玻璃時(shí)的透射現(xiàn)象，稱(chēng)為電子束“透鏡”，利用透過(guò)樣品的電子束成像。透射電鏡在材料科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，可實(shí)現(xiàn)樣品形貌觀(guān)察、物相分析、確定晶格結(jié)構(gòu)、觀(guān)察晶格缺陷、化學(xué)成分分析、元素分析等功能，成為在光學(xué)顯微鏡不能達(dá)到要求時(shí)進(jìn)行微觀(guān)分析和檢測(cè)的不可或缺的工具。
    (3)X射線(xiàn)顯微鏡
    20世紀(jì)50年代以來(lái)，出現(xiàn)了一種不用光波或電子而用X射線(xiàn)作為信息載體的顯微鏡，它為人們提供了一種更深入觀(guān)察微觀(guān)世界的方法。X射線(xiàn)是指波長(zhǎng)為(0.01～30)nm的輻射波，其中，(1～30)nm的波段稱(chēng)為軟X射線(xiàn)。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)積極進(jìn)行的X射線(xiàn)顯微術(shù)方面的研究主要集中在軟X射線(xiàn)波段。軟X射線(xiàn)顯微鏡的突出優(yōu)點(diǎn)是可以在生物活細(xì)胞被破壞之前得出其表面特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖像，這是電子顯微鏡無(wú)法得到的。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著X射線(xiàn)激光器的開(kāi)發(fā)與發(fā)展，獲得了短脈沖、高亮度和相干性強(qiáng)的X射線(xiàn)激光光源，此外，用于X射線(xiàn)的光學(xué)元件與高分辨率、高靈敏度的X射線(xiàn)探測(cè)器技術(shù)的發(fā)展為X射線(xiàn)顯微鏡的發(fā)展創(chuàng)造了必要條件，使其具有高空間分辨、能譜分辨和時(shí)間分辨能力。
    目前，X射線(xiàn)顯微鏡主要包括接觸型、成像型、掃描型以及全息型四種類(lèi)型。圖4為軟X射線(xiàn)接觸顯微成像示意圖，它用光敏物質(zhì)作為抗蝕材料，將實(shí)驗(yàn)樣品貼在對(duì)X射線(xiàn)靈敏的感光膠上，經(jīng)過(guò)軟X射線(xiàn)曝光及顯影，再用電子顯微鏡觀(guān)察其影像即可得到細(xì)胞的顯微圖，這種方法比較簡(jiǎn)單和方便，分辨率可達(dá)10nm。
   

    圖4  軟X射線(xiàn)接觸顯微成像簡(jiǎn)圖

   （待續(xù)）

成像型軟X射線(xiàn)顯微鏡模擬光學(xué)成像原理，用聚焦系統(tǒng)將影像放大數(shù)百倍，然后由光電耦合(CCD)探測(cè)器實(shí)時(shí)記錄，聚焦系統(tǒng)以波帶片代替透鏡。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以照射整個(gè)樣品并實(shí)時(shí)成像，非常適合實(shí)際應(yīng)用，其分辨率可達(dá)(50～60)nm。軟X射線(xiàn)掃描顯微鏡是用波帶片將軟X射線(xiàn)聚焦成一個(gè)微束，照亮樣品上的一個(gè)點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)X射線(xiàn)的透射率確定了像素的灰度值，對(duì)樣品逐行逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，圖像便以一次一個(gè)像素方式形成，很像電視屏上的圖像。這種顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是樣品輻射損傷小，缺點(diǎn)是需逐點(diǎn)記錄得出圖像，要求空間相干照明，且不能使用脈沖X射線(xiàn)光源。全息型X射線(xiàn)顯微鏡基于波的干涉原理，它不需要聚焦裝置，只需要強(qiáng)X射線(xiàn)光源和高分辨率的記錄材料，可獲得樣品的三維全息影像。用(0.1～1)nm的X射線(xiàn)激光全息術(shù)可進(jìn)行表面物理、原子分子物理、化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力等高分辨率快速過(guò)程的研究。
    X射線(xiàn)顯微鏡與電子顯微鏡功能上互為補(bǔ)充，電子顯微鏡可達(dá)到極高的分辨率——(0.2～2)nm，現(xiàn)有X射線(xiàn)顯微鏡的分辨率是在幾十納米的量級(jí)，由于受到X射線(xiàn)衍射限度的限制，X射線(xiàn)顯微鏡的分辨率難以超越電子顯微鏡。因此，X射線(xiàn)顯微鏡的主要貢獻(xiàn)并不在于分辨率極限的突破，而在于它在很接近于生物體自然狀態(tài)的環(huán)境下，對(duì)改變很少或完全沒(méi)有改變的生物樣品進(jìn)行定量測(cè)定的能力。因此，X射線(xiàn)顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用更加引人注目，從被重金屬污染了的生物到人體內(nèi)的癌細(xì)胞，X射線(xiàn)顯微鏡為人類(lèi)在原子尺度考察生命提供了幫助。
    (4)近場(chǎng)顯微鏡
    近場(chǎng)顯微鏡的概念是由Wickramasinghe提出的，最早由掃描探針顯微鏡(SPM)的測(cè)量原理延伸得到。它是一種全新的測(cè)量原理，即使得一個(gè)非常尖的探針?lè)浅＝亟咏鼧悠罚怪c被測(cè)表面在近場(chǎng)范圍產(chǎn)生掃描力，對(duì)這種掃描力進(jìn)行探測(cè)可獲得樣品表面的形貌信息。近場(chǎng)顯微鏡具有非常高的分辨率，因?yàn)樗鼌^(qū)別于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡之處在于，不再用光子或粒子束照亮樣品，因而突破了由于射線(xiàn)衍射造成的分辨率極限。近場(chǎng)顯微鏡的關(guān)鍵之處是各種形式的探針在原子直徑量級(jí)上的精確機(jī)械掃描，以及探針在近場(chǎng)范圍對(duì)樣品表面進(jìn)行原子和分子量級(jí)的探測(cè)。
    掃描探針顯微鏡家族的第一個(gè)成員是掃描隧道顯微鏡(STM)，它是由IBM瑞士蘇黎世實(shí)驗(yàn)室的G.Beinning和H.Rohrer于1982年發(fā)明的，接下來(lái)是原子力顯微鏡(AFM)。此后，又陸續(xù)發(fā)明了多種利用掃描力測(cè)量的顯微鏡，如近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(NOM)、近場(chǎng)聲學(xué)顯微鏡(NAM)、摩擦力顯微鏡(FFM)、磁力顯微鏡(MFM)、靜電力顯微鏡(EFM)和化學(xué)力顯微鏡(CFM)等，使得SPM的組成和應(yīng)用領(lǐng)域大大擴(kuò)大。
    SPM作為新型顯微工具與以往的各種顯微鏡和分析儀器相比有著其明顯地優(yōu)勢(shì):首先，SPM具有極高的分辨率。它可以輕易地“看到”原子，這是一般顯微鏡甚至電子顯微鏡所難以達(dá)到的。其次，SPM得到的是實(shí)時(shí)的、真實(shí)的樣品表面的高分辨率圖像，而不同于某些分析儀器是通過(guò)間接的或計(jì)算的方法來(lái)推算樣品的表面結(jié)構(gòu)。也就是說(shuō)，SPM是真正看到了原子。再次，SPM的使用環(huán)境寬松。電子顯微鏡等儀器對(duì)工作環(huán)境要求比較苛刻，樣品必須安放在高真空條件下才能進(jìn)行測(cè)試。而SPM既可以在真空中工作，又可以在大氣中、低溫、常溫、高溫甚至在溶液中使用。因此，SPM適用于各種工作環(huán)境下的科學(xué)實(shí)驗(yàn)。SPM的缺點(diǎn)在于:一方面，由于其工作原理是控制具有一定質(zhì)量的探針進(jìn)行掃描成像，因此掃描速度受到限制，檢測(cè)效率較其他顯微技術(shù)低；此外，由于壓電效應(yīng)在保證定位準(zhǔn)確度前提下運(yùn)動(dòng)范圍很小(目前難以突破100μm量級(jí))，而機(jī)械調(diào)節(jié)準(zhǔn)確度又無(wú)法與之銜接，故不能做到像電子顯微鏡那樣大范圍連續(xù)變焦，定位和尋找特征結(jié)構(gòu)比較困難。雖然存在缺點(diǎn)，但SPM的應(yīng)用領(lǐng)域還是非常寬廣的，無(wú)論是物理、化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科，還是材料、微電子等應(yīng)用學(xué)科都有它的用武之地。預(yù)計(jì)在未來(lái)的科學(xué)發(fā)展中，SPM將具有更大的應(yīng)用前景。
    三、顯微技術(shù)在長(zhǎng)度計(jì)量中的應(yīng)用
    顯微技術(shù)是長(zhǎng)度計(jì)量的基本技術(shù)，近年來(lái)，顯微技術(shù)與光干涉技術(shù)相結(jié)合在長(zhǎng)度計(jì)量領(lǐng)域的各分支(如量塊計(jì)量、角度計(jì)量、工程參量計(jì)量、表面輪廓以及納米計(jì)量)中發(fā)揮了重要作用，使得古老的顯微技術(shù)煥發(fā)了新的活力。
    1.在幾何尺寸測(cè)量中的應(yīng)用
    測(cè)量顯微鏡是長(zhǎng)度計(jì)量的常用精密測(cè)量?jī)x器，主要用于工件幾何尺寸的測(cè)量。從小型測(cè)量顯微鏡到大型工具顯微鏡，測(cè)量顯微鏡的類(lèi)型多種多樣，測(cè)量準(zhǔn)確度一般為微米量級(jí)，分辨率可達(dá)到0.1μm。
    2.在表面形貌測(cè)量中的應(yīng)用
    表面形貌測(cè)量是長(zhǎng)度計(jì)量的一個(gè)分支，傳統(tǒng)儀器有光切顯微鏡和干涉顯微鏡，光切顯微鏡的分辨率最高可達(dá)到0.1mm，而干涉顯微鏡則可達(dá)到15nm。它們所針對(duì)的主要是微米、亞微米量級(jí)的工件粗糙度的測(cè)量。
    隨著表面加工質(zhì)量的不斷提高，對(duì)微觀(guān)形貌測(cè)量技術(shù)提出了更高的要求。輪廓儀、掃描電鏡以及掃描探針顯微鏡的應(yīng)用解決了這一問(wèn)題。其中，STM和AFM的發(fā)明為表面形貌測(cè)量的進(jìn)一步發(fā)展注入了新的活力，使其步入了納米時(shí)代。當(dāng)前，表面形貌測(cè)量正朝著應(yīng)用非接觸式且具有高分辨率，以及可對(duì)表面結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行描繪的電子顯微鏡方向發(fā)展。
    3.在線(xiàn)寬和掩模測(cè)量中的應(yīng)用
    隨著電子行業(yè)的發(fā)展，特別是超大規(guī)模集成芯片制造業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，電子元器件向著結(jié)構(gòu)尺寸小型化和高集成密度化方向前進(jìn)，從而對(duì)線(xiàn)寬計(jì)量和掩模計(jì)量提出更高的需求。近年來(lái)，共焦顯微鏡的應(yīng)用為線(xiàn)寬和掩模測(cè)量提供了新的測(cè)量手段。共焦顯微鏡的原理如圖5所示，激光通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)焦透鏡后形成發(fā)散光束，再經(jīng)短焦物鏡匯聚透射到樣品表面并反射回短焦物鏡，經(jīng)分光鏡后通過(guò)一個(gè)小孔光闌由光電接收器接收。小孔光闌的位置正好位于長(zhǎng)焦透鏡的焦點(diǎn)上，因而構(gòu)成共焦關(guān)系。當(dāng)測(cè)量點(diǎn)正好位于物鏡焦點(diǎn)上時(shí)，光電接收器上可得到最大的信號(hào)，隨著測(cè)量點(diǎn)偏離焦點(diǎn)，信號(hào)隨之變小，信號(hào)的大小即反映了樣品表面高低的變化。小孔的直徑對(duì)其測(cè)量分辨率起決定作用，目前，共焦顯微鏡的測(cè)量分辨率可達(dá)到10nm。
   

    圖5  共焦顯微鏡成像原理圖

四、結(jié)束語(yǔ)
    回顧幾百年來(lái)顯微技術(shù)的發(fā)展，顯微鏡就像人類(lèi)的第三只眼睛，為我們探索和研究微觀(guān)世界開(kāi)啟了一扇門(mén)。近幾十年，顯微技術(shù)的奮斗目標(biāo)主要是力求觀(guān)察更微小的物體結(jié)構(gòu)、更細(xì)小的實(shí)體，甚至單個(gè)原子，并獲得有關(guān)試樣的更多的信息。古老的顯微技術(shù)在激光技術(shù)和電子技術(shù)的激勵(lì)下迸發(fā)出新的能量。相信在未來(lái)的科學(xué)發(fā)展中，現(xiàn)代新型顯微鏡的應(yīng)用將滲透到各個(gè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
    作者單位【王蔚晨  楊自本  中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、何冬琦  廣東省計(jì)量科學(xué)研究院、莫偉平  云南省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院】