色譜柱維護(hù)

色譜柱維護(hù)
防止色譜柱堵塞
原因1：溶劑中的不溶物應(yīng)使用色譜純?nèi)軇み^濾（孔徑不超過0.45μm）
原因2：樣品中的不溶物應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行膜過濾（孔徑不超過0.45μm）
原因3：泵，進(jìn)樣器等中的不溶物在泵和進(jìn)樣器之間安裝內(nèi)置過濾器，在進(jìn)樣器和柱之間安裝預(yù)過濾器
原因4：柱內(nèi)不溶物的形成
　　4-1．由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱
　　4-2．在不互溶溶劑中由于進(jìn)樣而產(chǎn)生的沉淀檢查樣品液和流動(dòng)相是否互溶
　　4-3．由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀將色譜柱密封緊，并保持室溫恒定
操作壓力上升故障排除
HPLC系統(tǒng)流程圖：
吸入過濾器>>泵>>內(nèi)置過濾器>>進(jìn)樣器>>預(yù)過濾器>>保護(hù)柱>>主分析柱>>檢測(cè)器和排放系統(tǒng)
　　從流程圖的末端依次斷開部件，如從檢測(cè)器開始斷開，最容易引起阻塞的部件是：預(yù)過濾器，保護(hù)柱和主分析柱。
[注]：應(yīng)記錄新柱子在常規(guī)分析條件下的操作壓力
柱堵塞的修復(fù)
步驟1：使用含鹽緩沖液后（如離子對(duì)試劑）應(yīng)用溶解性強(qiáng)的溶劑（如水）進(jìn)行沖洗
步驟2：先斷開檢測(cè)器，然后用對(duì)來自樣品中的物質(zhì)有強(qiáng)溶解性的溶劑進(jìn)行沖洗。對(duì)于反相色譜柱，可使用甲醇，乙睛，四氫呋喃，氯仿，庚烷等，在此條件下，應(yīng)避免溶劑的pH低于2或高于8,若經(jīng)過步驟1和步驟2后，壓力仍沒下降至步驟3
步驟3：斷開檢測(cè)器，將色譜柱反方向放置，然后檢查柱壓
　　1.若壓力穩(wěn)定下降，至步驟4
　　2.若壓力不下降，至步驟5
步驟4：保持色譜柱反方向連接，用低于0.5 ml/min 流速?zèng)_洗1小時(shí),若步驟4不能降壓，至步驟5
步驟5：若內(nèi)置過濾器被堵塞，應(yīng)沖洗或更換。柱連接端的拆卸或重裝會(huì)導(dǎo)致柱效下降，（有效塔板數(shù)下降和不對(duì)稱峰），若步驟5不能降低柱壓，至步驟6
步驟6：若進(jìn)口端的填料發(fā)生堵塞，柱子將不可能被徹底恢復(fù)，只能通過去掉進(jìn)口端的部分填料，重新填充進(jìn)行有限的柱效恢復(fù)。（2~5mm）
[注]：在多數(shù)情況下，柱效將嚴(yán)重地下降
步驟7：若步驟6無法改善柱子性能，那么柱子已無法修復(fù)，請(qǐng)注意當(dāng)拆開連接端時(shí)柱子已不再得到質(zhì)量保證。
柱效的下降：
導(dǎo)致柱有效塔板數(shù)和分離能力下降的主要原因是固定相的惡化和硅膠表面活性鏈的損失，在這些條件下柱子已不可能再恢復(fù)

色譜柱的日常維護(hù)
液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
  一、液相色譜柱的安裝：
   1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
   a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
    柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋(國(guó)內(nèi)外已規(guī)范化)。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長(zhǎng)或其他固定尺寸)。
    在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
   b、柱填料：
    液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
    正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
    反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
    常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。
   2，色譜柱的安裝：
   a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
   b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
   c、按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心 螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí) 針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4-1／2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動(dòng)相 加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1／4圈，直至不漏液為止。二、液相色譜柱的使用：
    色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能 可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中 的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

1、樣品的前處理：
   a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。
   b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
   c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制：
    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
   a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
   b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
   c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
   d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
   e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
   f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
   3、流動(dòng)相流速的選擇：
    因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最 佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速 0.8ml／min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
   注意：
   1．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。
   2．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆 歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
   3．含水流動(dòng)相最奸在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
   4．流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
   5．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
   4、柱性能測(cè)試：
   ——啟動(dòng)液相色譜儀：
       a、流動(dòng)相流速設(shè)定為1ml／min。
       b、UV檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254nm。
            ——使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。
            ——記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。
            *參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。