生物芯片技術

一、生物芯片簡介
生物芯片（biochip）是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯攝影像機（CCD）對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術，所以稱之為生物芯片技術。根據芯片上的固定的探針不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片，另外根據原理還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白，則稱為肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探針或DNA，就是DNA芯片。DNA微陣列(DNA Microarray)是目前最重要的一種，有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分，包括二種模式：一是將靶DNA固定于支持物上，適合于大量不同靶DNA的分析，二是將大量探針分子固定于支持物上，適合于對同一靶DNA進行不同探針序列的分析。
生物芯片技術是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業化前景。由于用該技術可以將極其大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交（Southern Blotting 和Northern Blotting等）技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少、低通量(low through-put)等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序（Sequencing by hybridization, SBH）等，為"后基因組計劃"時期基因功能的研究及現代醫學科學及醫學診斷學的發展提供了強有力的工具，將會使新基因的發現、基因診斷、藥物篩選、給藥個性化等方面取得重大突破，為整個人類社會帶來深刻廣泛的變革。該技術被評為1998年度世界十大科技進展之一。

二、生物芯片的應用領域

1 、基因表達水平的檢測
用基因芯片進行的表達水平檢測可自動、快速地檢測出成千上萬個基因的表達情況。Schena等采用擬南芥基因組內共45個基因的cDNA微陣列（其中14個為完全序列，31個為EST），檢測該植物的根、葉組織內這些基因的表達水平，用不同顏色的熒光素標記逆轉錄產物后分別與該微陣列雜交，經激光共聚焦顯微掃描，發現該植物根和葉組織中存在26個基因的表達差異，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達高500倍。Schena等用人外周血淋巴細胞的cDNA文庫構建一個代表1046個基因的cDNA微陣列，來檢測體外培養的T細胞對熱休克反應后不同基因表達的差異，發現有5個基因在處理后存在非常明顯的高表達，11個基因中度表達增加和6個基因表達明顯抑制。該結果還用熒光素交換標記對照和處理組及RNA印跡方法證實。在HGP完成之后，用于檢測在不同生理、病理條件下的人類所有基因表達變化的基因組芯片為期不遠了。 　

2 、基因診斷
從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術以其快速、高效、敏感、經濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現代化診斷新技術。例如Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發揮作用。又如，Heller等構建了96個基因的cDNA微陣，用檢測分析風濕性關節炎（RA）相關的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應用。現在，肝炎病毒檢測診斷芯片、結核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進入市場。基因診斷是基因芯片中最具有商業化價值的應用。

3、 藥物篩選
如何分離和鑒定藥的有效成份是目前中藥產業和傳統的西藥開發遇到的重大障礙，基因芯片技術是解決這一障礙的有效手段，它能夠大規模地篩選、通用性強，能夠從基因水平解釋藥物的作用機理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機體的不同組織、器官基因表達的差異。如果再c DNA表達文庫得到的肽庫制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質。還有，利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復雜的空間結構，更有利與靶分子相結合，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白孵育，形成蛋白質-RNA或蛋白質-DNA復合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此芯片技術和RNA庫的結合在藥物篩選中將得到廣泛應用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學合成及DNA芯片技術篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結構的抑制物，實驗表明，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用。生物芯片技術使得藥物篩選，靶基因鑒別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片藥物篩選技術工作目前剛剛起步，美國很多制藥公司已開始前期工作，即正在建立表達譜數據庫，從而為藥物篩選提供各種靶基因及分析手段。這一技術具有很大的潛在應用價值。

4、 個體化醫療
臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效可能對病人乙不起作用，而對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應差異很大。這主要是由于病人遺傳學上存在差異（單核苷酸多態性，SNP），導致對藥物產生不同的反應。例如細胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關，如果病人該酶的基因發生突變就會對降壓藥異喹胍產生明顯的副作用，大約5%~10%的高加索人缺乏該酶基因的活性。現已弄清楚這類基因存在廣泛變異，這些變異除對藥物產生不同反應外，還與易犯各種疾病如腫瘤、自身免疫病和帕金森病有關。如果利用基因芯片技術對患者先進行診斷，再開處方，就可對病人實施個體優化治療。另一方面，在治療中，很多同種疾病的具體病因是因人而異的，用藥也應因人而異。例如乙肝有較多亞型，HBV基因的多個位點如S、P及C基因區易發生變異。若用乙肝病毒基因多態性檢測芯片每隔一段時間就檢測一次，這對指導用藥防止乙肝病毒耐藥性很有意義。又如，現用于治療AIDS的藥物主要是病毒逆轉錄酶RT和蛋白酶PRO的抑制劑，但在用藥3-12月后常出現耐藥，其原因是rt、pro基因產生一個或多個點突變。Rt基因四個常見突變位點是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四個位點均突變較單一位點突變后對藥物的耐受能力成百倍增加。如將這些基因突變部位的全部序列構建為DNA芯片，則可快速地檢測病人是這一個或那一個或多個基因發生突變，從而可對癥下藥，所以對指導治療和預后有很大的意義5、 測序
基因芯片利用固定探針與樣品進行分子雜交產生的雜交圖譜而排列出待測樣品的序列，這種測定方法快速而具有十分誘人的前景。Mark chee等用含135000個寡核苷酸探針的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因組序列，準確率達99%。Hacia等用含有48000個寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異，結果發現在外顯子11約3.4kb長度范圍內的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，提示了二者在進化上的高度相似性。據未經證實的報道，去年有一種不成熟的生物芯片在15分鐘內完成了1．6萬個堿基對的測定，96個這樣的生物芯片的平行工作，就相當于每天1．47億個堿基對的分析能力！
6、 生物信息學研究
人類基因組計劃（HGP）是人類為了認識自己而進行的一項偉大而影響深遠的研究計劃。目前的問題是面對大量的基因或基因片斷序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正體現HGP計劃的價值--破譯人類基因這部天書。后基因組計劃、蛋白組計劃、疾病基因組計劃等概念就是為實現這一目標而提出的。基因的功能并不獨立的,一個基因表達的上調或者下調往往會影響上游和下游幾個基因表達狀態的改變，從而進一步引起和這幾個基因相關的更多基因的表達模式的改變。基因之間的這種復雜的相互作用組成了一張交錯復雜的立體的關系網。像過去那樣孤立的理解某個基因的功能已經遠遠不夠了，需要我們站在更高的層次全面的理解這種相互關系，全面了解不同個體基因變異、不同組織、不同時間、不同生命狀態等的基因表達差異信息，并找出其中規律。生物信息學將在其中扮演至關重要的角色。基因芯片技術就是為實現這一環節而建立的，使對個體生物信息進行高速、并行采集和分析成為可能，必將成為未來生物信息學研究中的一個重要信息采集和處理平臺，成為基因組信息學研究的主要技術支撐。比如研究基因生物學功能的最好方式是監測基因在不同組織、不同發育階段、不同健康狀況下在機體中活性的變化。這是一項非常麻煩的工作，但基因芯片技術可以允許研究人員同時測定成千上萬個基因的作用方式，幾周內獲得的信息用其它方法需要幾年才能得到。

7、實際應用

在實際應用方面，生物芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、藥物基因組圖譜、藥物篩選、中藥物種鑒定、農作物的優育優選、司法鑒定、食品衛生監督、環境檢測、國防等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳、發育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺，這從我國99年3月國家科學技術部剛起草的《醫藥生物技術“十五”及2015年規劃》中便可見一斑：規劃所列十五個關鍵技術項目中，就有八個項目（基因組學技術、重大疾病相關基因的分離和功能研究、基因藥物工程、基因治療技術、生物信息學技術、組合生物合成技術、新型診斷技術、蛋白質組學和生物芯片技術）要使用生物芯片。生物芯片技術被單列作為一個專門項目進行規劃。

三、DNA微陣列技術在癌癥機制研究中的應用

在多年的癌癥疾病研究中，科學家和醫學工作者們認識到，癌癥并不只是某一種疾病，在它的背后，隱藏著形形色色，變化多端的種類，有幾百種這樣的癌癥存在著。它們為什么一直難以攻克呢？其主要的原因是由于每一種癌癥都有自己的特點，一種藥物并不能對各個不同組織的癌癥都能產生療效，有些能抑制住腫瘤細胞，但有些卻毫無作用，甚至在病癥上相同的癌癥，也無法用一種藥物達到治療的目的。現在，有一種新的技術可以幫助我們區分這些癌癥，并加以定義，而且還能幫助我們尋找新的治療藥物。

微陣列技術已經將我們帶進了癌癥的內部世界。一些實驗室的研究者們就已經用這種技術鑒定了一些癌癥的特定亞型，包括白血病、淋巴瘤、危險的惡性皮膚癌以及乳腺癌。他們從中可以了解目前的治療方法對哪些癌癥是有效的，哪些是沒有作用的。麻省理工學院基因組研究中心的一個研究小組曾經宣稱，用基因表達譜將癌癥進行分類的設想是完全可以實現的（Science,1999）。他們于是開始比較急性髓性白血病（AML）和急性淋巴性白血病（ALL）的基因表達譜。這兩種白血病在臨床的標準病理檢測中難以區分。研究人員從38位ALL和AML患者的骨髓細胞中抽提了mRNA，用生物素進行標記，分別與帶有6800個人的基因的芯片（由Affymetrix提供）進行雜交，來檢測基因的表達情況。經過計算，挑選出了50個差異表達的基因。這些基因的挑選是依據數學方法。研究小組的領導人Golub說，因為我們開始無法預料哪些基因能提供更多的信息。這個結果表明他們已經可以用這些基因表達譜來區分38個患者中哪些是AML，哪些是ALL。對另一組36個患者也能做出同樣的區分。盡管專家們早就知道AML和ALL是兩種白血病，"但從表達水平上做出解釋仍然是十分必要的。"Jeff Trent說。

從那以后，研究者們紛紛開始用基因表達譜來揭示一些未知的癌癥類型。Staudt的研究小組就開展了許多這樣的工作。他們與斯坦福大學醫學院的Patrick Brown和David Botstein小組合作，研究大面積擴散的B細胞淋巴瘤。這是一種非霍吉金氏病，在美國每年有一萬五千多人的發病率，而且臨床上變易大，只有40%的患者可以被治愈，60%的患者會死亡。微陣列技術的分析也許可以幫助我們找到答案。

第一階段的工作成果發表在了Nature上。研究人員制作了一種他們稱為"Lymphochip"的芯片，上面排列有18,000個基因，大多數基因在正常和惡性淋巴細胞中都表達。然后，他們從40位患者的組織中分離了mRNA，用熒光標記cDNA，與"Lymphochip"雜交。Staudt說："我們發現40位患者的基因表達有很大的差異，盡管他們都經過了相同的臨床診斷。"

根據計算機分析的基因表達譜結果，可以將40位患者分成兩組，一組患者中，發生免疫應答的脾臟和淋巴結的B細胞特征性的表達了一類基因；而另一組患者中，這些基因卻沒有表達，但在受到抗原刺激后發生分裂的血液中的B細胞表達了另外一類基因。"由此，"Stault說道，"我們認為這些患者得的是兩種不同的疾病。"的確，這兩組患者的臨床檢測結果也有所不同，脾－淋巴結B細胞譜的情況要好一些，經診斷后有75%的患者多活了5年，而另一組恰恰相反。Staudt的小組目前正在進行一個稱為淋巴瘤－白血病的分子分型的合作研究項目，要對幾百個B細胞淋巴瘤患者做出分析，來驗證他們的結論。不過，他們已經提出了可能的治療方案。淋巴瘤患者的治療首先是要進行化療，如果有復發情況，就要進行骨髓移植。在以后，那些預后差的患者就可以直接進行骨髓移植，無需作化療，以免使身體更加虛弱。

DNA微陣列技術并不只用在血液癌癥的分類研究。NHGRI小組在Nature上發表了他們黑色素瘤分類的研究成果。通過研究基因的表達譜，他們將31位在腫瘤病理檢測中沒有差異的黑色素瘤患者分成兩類，這兩種類型是否能與臨床聯系起來，還不得而知。但已經有了一些數據表明了其可能性。比如，占多數的患者的表達譜中，相當一些表達下調的基因都與細胞遷移有關。這一點是與腫瘤細胞運動能力的減弱是一致的。這也就意味著腫瘤細胞的擴散能力減弱了。

斯坦福大學的Brown和Bostein還有他們的同事們也在利用微陣列技術尋找乳腺癌的亞類型。他們也得到了兩個不同的腫瘤類群。這兩類的基因表達差異體現在雌激素受體。這也是在預料之中的，我們早就知道，雌激素受體缺乏的乳腺癌更為嚴重。但是，他們后來還發現，這類癌癥還能細分出許多亞群。例如，帶有雌激素受體的一類腫瘤細胞的基因表達譜不僅與哺乳動物的排泄管基細胞十分相似，與另一種高表達Erb-B2腫瘤基因的的細胞也很相似。

這些早期的研究很清楚的表明了利用微陣列技術可以高通量的檢測基因的表達，但是，更有意義的結果并不在于我們只知道哪些基因的表達是上調還是下調，而是要鑒定出哪些基因是對癌癥的病因和發展緊密相關的。例如，MIT的研究小組在比較高轉移黑色素瘤細胞和低轉移黑色素瘤細胞的基因表達譜，找到了一組隨著腫瘤的惡化表達明顯上調的基因。

這些基因中，許多都是參與了癌細胞的轉移，直接或間接的影響到細胞的移動和進攻性。例如，MIT的一個研究小組深入的研究了一個稱為RhoC的基因，這個基因曾經報道過與胰腺癌的轉移有關。他們將這個基因轉到人的黑色素瘤細胞（無擴散傾向）中，然后接種到小鼠上，他們發現這些細胞具有高度的轉移性。另一項熱門的領域是研究人員利用微陣列技術來研究那些激發腫瘤產生的癌基因和抑制腫瘤的癌基因是如何干擾其它基因表達的。Klausner（MTI）說，微陣列工具可以闡明特定遺傳缺陷及如何調控的相互關系。Staudt小組就曾經用Lymphochip來研究BCL-6基因的異常活動的情況，這在淋巴細胞中是很常見的情況。過去，我們知道BCL-6基因的表達產物會抑制某些基因的表達，NCI的研究人員正是想找出其中導致癌發生的變化。他們發現BCL-6基因的活動會導致blimp-1基因表達的抑制，blimp-1基因的功能是促進B細胞的分化，變成一個可以分泌抗體的血細胞。另一個受到影響的基因是p27kip1，它會影響細胞的分裂周期。這兩個基因對細胞產生雙重作用，使細胞保持在在一個分化停滯，不斷分裂的狀態。

在西雅圖Fred Hutchinson癌癥研究中心的Eisenman小組與MIT合作研究Myc基因的活性變化，這項研究結果發表在3月份的PNAS上。他們發現，Myc基因的活性會引起27個基因的上調表達，這些基因中包括一些促進細胞分裂的基因。同時還引起另外9個基因的下調表達。"我們正在發現這些腫瘤的惡化途徑，現在我們可以研究這些干預的途徑是否有所幫助。

另一塊利用微陣列技術研究癌癥的熱點是癌細胞在化療下的應答機制，以及哪些癌細胞能夠發生應答，而哪些不能。其實，微陣列技術的應用是無窮無盡的。

隨著微陣列技術的研究和應用急劇增加，由此而帶來的數據象洪水一樣"泛濫"，我們不得不面對這樣一個嚴峻的問題：怎樣處理這些日益增多的數據？僅僅去分析還不夠，還要知道怎樣去利用和比較它們。而且，不同的研究人員所使用的技術平臺和不同的方法，沒有一個標準化的尺度，就很難將這些結果統一起來，評定結果的可靠性。

針對這些問題，NCI已經建立了一個基因表達分析工作小組，專門來研究芯片領域中遇到的種種問題，尋找解決方案。盡管我們對微陣列技術的有著極大的研究熱情，但最終還是朝著臨床的方向發展。