計量論壇

標題: 微球在流式熒光中的應用 [打印本頁]

作者: vandyke 時間: 2008-7-5 21:36
標題: 微球在流式熒光中的應用
流式熒光技術，是基于美國Luminex公司研制的多功能流式點陣儀（Luminex 100?）開發的高速度、高通量、并行檢測的生物技術平臺。它有機地整和了編碼微球（color-coded beads）、激光技術、應用流體學、最新的高速數字信號處理器和計算機運算法則，造就了其無與倫比的檢測特異性和靈敏度，可廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，得到各權威機構和醫學界高度認可，是臨床診斷領域以及生命科學研究中的一大熱點。
流式熒光技術是基于激光激發熒光的發光類技術之一，又稱懸浮陣列、液態芯片。具有三大無與倫比的核心優勢：
? 微量標本，1檢測，100個指標
? 既能檢測蛋白，又能檢測核酸
? 既能用于臨床，又能用于科研
流式熒光技術原理：
該技術的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6μm）用熒光染色的方法進行編碼（微球的顏色是通過兩種熒光染料染色得到的，調節兩種熒光染料的比例可以獲得100種不同顏色的微球），然后將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）共價交聯上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。應用時，先把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯的分子進行特異性地結合，在一個反應孔內可以同時完成多達100種不同的生物學反應。最后用Luminex?100進行分析，儀器通過兩束激光分別識別編碼微球和檢測微球上報告分子的熒光強度。因為分子雜交或免疫反應是在懸浮溶液中進行，檢測速度極快，而且可以在一個微量液態反應體系中同時檢測多達100個指標。

流式熒光技術優點：
1、高通量：僅需微量樣本（10μl），1次檢測，最多100個指標；
2、高速度：最快可達10000測試/小時；
3、低成本：流式熒光聯檢的試劑用量少，能有效降低臨床應用的試劑成本；
4、靈敏度高：檢測低限可達10pg/ml；
5、重復性好：每個指標有5000個反應單元，分析100次取平均值；
6、線性范圍廣：檢測范圍達6個數量級；
7、無需洗滌：減少誤差來源，且操作簡便、省時省力。
權威認證：
1997年，Clinical Chemistry雜志刊登專文介紹多功能流式點陣儀及其技術，并將其譽為“真正的臨床應用型生物芯片”。隨后，運用多功能流式點陣儀及其技術進行臨床診斷和基礎研究成為生命科學研究領域的一大熱點，相關的研究論文頻頻刊登在Nature、Clinical Chemistry、Clin Biochem、Clin Chem Lab Med、Clin Diagn Lab Immunol、Lancet Oncol、Journal of Molecular Diagnostics、Genome Res、J Proteome Res、Cytometry、Journal of Clinical Microbiology、Clin Dev Immunol、Cancer、Cancer Research等國際權威學術雜志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式點陣試劑率先通過美國FDA的嚴格認證，標志著多功能流式點陣儀及其技術得到了美國官方的高度認可，并由此成為首個，也是目前唯一得到美國FDA許可用于臨床診斷的多指標并行檢測技術。2005年6月9日，基于xMAP技術的學術論文刊登在當日出版的《自然》雜志上，這是學術界認可一項技術所能給予的最高榮譽。2005年11月，為了表彰其對臨床診斷技術進步做出的革命性貢獻，全球科技產業和行業研究的權威機構Frost & Sullivan授予xMAP技術“2005年度國際臨床診斷技術革新大獎”，標志著xMAP技術在國際臨床診斷技術領域的領軍地位得到了最具權威的認可。
獨特優點：
液態芯片的獨特設計使得它擁有常規檢測方法所不具備的優點：
高通量：因為許多種不同熒光編碼的微球可以放在同一個反應體系內，所以一次可以同時檢測多種（100種）生理病理指標。這與傳統方法的逐個檢測相比是一個質的飛躍。
高敏感：液態芯片最高的靈敏都可達0.01pg，常規的酶標（ELISA）方法只能是ug級。靈敏度提高10－100倍。液態芯片技術應用時，每個微球上都以共價結合的方式包被上許多抗原、抗體或核酸分子。因其參與反應的分子多，反應基本是在類均相的條件下進行的，反應充分，產生的信號強。加上使用激光激發熒光檢測，所以敏感性大大高于常規的酶標、玻璃或膜生物芯片等方法，與發光的方法比，敏感性等同或略高。
線性范圍寬：檢測的線性范圍比常規的ELISA方法高10倍以上，可以達到3-5個數量級。檢測濃度范圍可以在pg-μg級。這明顯優于酶免疫分析吸光度2個數量級的檢測范圍。
反應快速：因為雜交或免疫反應在懸浮的液相中進行，所以反應需要時間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數，所以檢測效率大大高于固相雜交，所用時間從幾小時縮短到十幾分鐘。
重復性好：固相芯片不能很好地應用于臨床診斷，其中一個重要的原因是其重復性差，這是固液雜交方式的芯片目前難以克服的技術障礙。但液態芯片雜交發生在準均相的液體環境中，其結果穩定，重復性非常好。另外，每個指標在一個反應體系中有1000－5000顆相同的微球。檢測時，抽取其中的100－500顆讀數，最終的數據是取其均值，這樣已經把誤差減到最小。而固相芯片每個指標只有 1－2個數據，其數據的可靠性就會差很多。
液相環境更有利于保持蛋白質的天然構象，也更有利于探針和被檢測物的反應。
操作簡便：凡有固體芯片應用經歷的操作者都會發現，與現有的大量采用自動化技術的臨床檢驗設備來說，芯片技術手工操作的步驟非常繁多。但此技術平臺的整個反應過程只涉及加樣和孵育，最后上機讀數，操作步驟少，非常簡單易用。
液態芯片應用
作為最新一代的多指標并行檢測技術平臺，多功能流式點陣儀具有檢測速度快、結果準確性高、操作簡便、功能強大、成本低廉等諸多優點，在臨床診斷、健康體檢、生物制藥、生物醫學（包括基因組學、蛋白質組學）研究等領域都有著廣泛的應用，代表著生命科學基礎研究和醫學診斷技術的發展方向。該儀器一經推出，便在醫學診斷與基礎研究的各個領域得到了迅速推廣，最近3年來更是以每年高達600～800臺的速度在迅猛遞增。根據Luminex公司提供的統計數據，截止2005年底，已有3400多臺多功能流式點陣儀在全球各大權威實驗室、臨床診斷科、主要的診斷試劑和生物技術公司、制藥企業中投入使用。
在液態芯片平臺上可以開發許多產品，根據檢測機理的不同，可大致分成兩大類：
蛋白芯片：基于的原理是抗原抗體的特異性相互作用，它所檢測的目標物是蛋白；
基因芯片：基于的原理是核酸分子雜交，它所檢測的目標物是核酸。
液態芯片技術平臺及其產品在生命科學研究的諸多領域有著廣泛的應用前景：
臨床診斷
基礎研究
免疫學分析
受體－配體分析
基因組學研究
蛋白質組學研究
酶與底物相互關系的研究
新藥開發
司法鑒定
食品衛生監督
生物武器防范
國內外目前有20余家公司正在研究基于液態芯片技術的產品，涉及的領域主要有：
1. 免疫學或基于免疫學原理進行的分析
- 腫瘤標志物檢測
- 細胞因子檢測
- 組織分型
- 自身免疫病檢測
- 過敏原篩查
- 心血管疾病標志物檢測
- 感染性疾?。ㄈ缫腋蔚龋┑臋z測
2. DNA雜交分析
- 感染性疾病病原微生物（如HPV等）的檢測
- SNP檢測
- 基因表達譜分析
3. 基因及蛋白質表達譜分析
- 蛋白質－蛋白質相互作用分析
- 蛋白質－DNA相互作用分析
4. 高通量藥物篩選平臺
- 高通量、大規模、并行進行藥物篩選
- 直接在蛋白水平尋找靶標
- 解釋藥物的作用機理及毒副作用
5. 受體－配體分析
- 內分泌激素分析
6. 酶與底物的相互作用的研究
- 激酶和磷酸化分析
- 金屬蛋白酶類分析

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