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計量論壇

標題: 高效液相色譜儀的幾個使用問題 [打印本頁]

作者: csxfjsw123 時間: 2007-8-30 20:01
標題: 高效液相色譜儀的幾個使用問題
1. 色譜柱中的流動相會排干嗎？
不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。相比之下，另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復到正常狀態。
2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問題？
如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調節錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規格的色譜柱相連接。
使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數HPLC應用系統壓力不會超過3000psi）。歡迎訪問西部藥學論壇
使用PEEK接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產生死體積或漏液。
3. 如何預防液相泵的故障:
要保持泵的良好操作性能,必須維護系統的清潔,保證溶劑和試劑的質量,對流動相進行過濾和脫氣.下面列出預防泵故障的幾項措施:
1).用高質量試劑和HPLC級溶劑；
2）、過濾流動相和溶劑；
3）、脫氣；
4）、每天開始使用時放空排氣，工作結束后從泵中洗去緩沖液；
5）、不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；
6）、定期更換墊圈；
7）、需要時加潤滑油；
8）、查閱有關泵操作手冊中的其它建議。
處于良好操作狀態的泵，應該能使色譜圖上的基線平穩；保留時間的重復性好。在等度洗脫時壓力波動小于2%。梯度洗脫時壓力變化應是緩慢和平穩的。
為了使故障發生后盡快排除，平時應常備密封、單向閥（入口與出口）、泵頭裝置、各式接頭、保險絲等部件，以及更換工具。

高效液相色譜常見故障的斷定及解決
診狀可能的原因解決方法
(一)保留時間變化
1.柱溫變化柱恒溫，必要時需配置恒溫箱
2.等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動相平衡柱
3.緩沖液容量不夠用>25mmol/L的緩沖液
4.柱污染每天沖洗柱
5.柱內條件變化穩定進樣條件,調節流動相
6.柱快達到壽命采用保護柱
(二)保留時間縮短
1.流速增加檢查泵,重新設定流速
2.樣品超載降低樣品量
3.鍵合相流失流動相PH值保持在3~7.5檢查柱的方向
4.流動相組成變化防止流動相蒸發或沉淀
5.溫度增加柱恒溫
(三)保留時間延長
1.流速下降管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內氣泡
2.硅膠柱上活性點變化用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱
3.鍵合相流失同前(二)3
4.流動相組成變化同前(二)4
5.溫度降低同前(二)5
(四) 出現肩峰或分叉
1.樣品體積過大用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
2.樣品溶劑過強采用較弱的樣品溶劑
3.柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件
4.柱內燒結不銹鋼失效更換燒結不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品
5.進樣器損壞更換進樣器轉子歡迎訪問西部藥學論壇h(五)鬼峰
1.進樣閥殘余峰每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗
2.樣品中未知物處理樣品
3.柱未平衡重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 每天新配,用抗氧化劑
5.水污染(反相) 通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水

(六) 基線噪聲
1.氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣,加柱后背壓
2.污染(隨機噪聲) 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑
3.檢測器燈連續噪聲更換氘燈
4.電干擾(偶然噪聲) 采用穩壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)
5.檢測器中有氣泡流動相脫氣,加柱后背壓
.(七)峰拖尾
1.柱超載降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
2.峰干擾清潔樣品,調整流動相
3.硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品
4.同前(四)4
5.同前(四)3
6.死體積或柱外體積過大連接點降至最低,對所有連接點作合適調整,盡可能采用細內徑的連接管
7.柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱
(八)峰展寬
1.進樣體積過大同(四)1
2.在進樣閥中造成峰擴展進樣前后排出氣泡以降低擴散
3.數據系統采樣速率太慢設定速率應是每峰大于10點
4.檢測器時間常數過大設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%
5.流動相粘度過高增加柱溫,采用低粘度流動相
6.檢測池體積過大用小體積池,卸下熱交換器
7.保留時間過長等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫
8.柱外體積過大將連接管徑和連接管長度降至最小
9.樣品過載進小濃度小體積樣品
問：用HPLC進行分析時保留時間有時發生漂移，有時發生快速變化，原因何在?如何解決?
答：關于漂移問題：
1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定
2、流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等
3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡
關于快速變化問題
1、流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定

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